Contraste de fase é uma técnica de microscopia de luz usada para melhorar o contraste de imagens de espécimes transparentes e incolores. Ele permite a visualização de células e componentes celulares que seriam difíceis de ver usando um microscópio de luz comum.
Como a microscopia de contraste de fase não exige que as células sejam mortas, fixadas ou coradas, a técnica permite que as células vivas, geralmente em cultura, sejam visualizadas em seu estado natural. Isso significa que os processos biológicos podem ser vistos e registrados com alto contraste e os detalhes da amostra podem ser observados. A coloração de fluorescência pode ser usada em combinação com o contraste de fase para melhorar ainda mais a visualização das amostras.
O contraste de fase é ideal para amostras mais finas, portanto, um sistema de microscópio invertido pode ser usado. Isso oferece a vantagem adicional de ter mais espaço de trabalho. O contraste de fase também pode ser instalado em microscópios verticais .
Se amostras mais espessas precisarem ser visualizadas em alta resolução, o contraste de interferência diferencial (DIC) é uma técnica mais adequada a ser usada.
Aplicações de contraste de fase
O contraste de fase é usado para visualizar amostras transparentes, quando a alta resolução não é necessária, incluindo:
- Células vivas (geralmente em cultura)
- Microrganismos
- Fatias de tecido fino
- fibras
- Partículas subcelulares, incluindo organelas
Componentes necessários para contraste de fase
É relativamente simples e barato adaptar um microscópio de luz invertido ou vertical para contraste de fase. Os seguintes componentes precisam ser instalados:
- Um condensador de contraste de fase com um anel de condensador (também conhecido como anel de fase ou anel de fase)
- Objetivos de contraste de fase - um conjunto de objetivos, cada um contendo uma placa de fase.
- Placa de fase - localizada no plano focal traseiro da objetiva.
Deve-se ter cuidado com o anel do condensador e os anéis de fase, pois eles precisam ser compatíveis em diâmetro e conjugados opticamente.
Como funciona o contraste de fase
A microscopia de contraste de fase traduz pequenas mudanças na fase em mudanças na amplitude (brilho), que são então vistas como diferenças no contraste da imagem.
Amostras não coradas que não absorvem luz são conhecidas como objetos de fase. Isso ocorre porque eles mudam ligeiramente a fase da luz que é difratada por eles; a luz é geralmente defasada em cerca de ¼ de comprimento de onda em comparação com a luz de fundo. Nossos olhos são incapazes de detectar essas pequenas diferenças de fase, pois só podem detectar variações na frequência e intensidade da luz.
O contraste de fase permite que imagens de alto contraste sejam produzidas aumentando ainda mais a diferença da fase de luz. É esta característica que permite que a luz de fundo seja separada da luz difratada da amostra. A diferença da fase da luz é aumentada diminuindo (ou avançando) a luz de fundo em um comprimento de onda de ¼, com uma placa de fase imediatamente antes do plano da imagem. Quando a luz é focada no plano da imagem, a luz difratada e de fundo causam interferência destrutiva (ou construtiva) que diminui (ou aumenta) o brilho das áreas que contêm a amostra, em comparação com a luz de fundo.
A luz de uma lâmpada de tungstênio-halogênio passa pelo anel do condensador no condensador de subestágio antes de atingir a amostra. Isso permite que a amostra seja iluminada por luz paralela que foi desfocada.
Parte da luz que passa pela amostra não será difratada (amarelo brilhante na imagem). Essas ondas de luz formam uma imagem brilhante na abertura traseira da objetiva. As ondas de luz que são difratadas pela amostra passam pelo plano difratado e focam apenas no plano da imagem. Isso permite que a luz de fundo e a luz difratada sejam separadas.
A placa de fase então muda a velocidade da luz de fundo em ¼ de comprimento de onda. Quando a luz é focada no plano da imagem, a luz difratada e de fundo causarão interferência destrutiva ou construtiva, que altera o brilho das áreas que contêm a amostra em comparação com a luz de fundo. Muitas vezes, o fundo também é escurecido em 60 a 90% por um anel de filtro cinza.
Alinhando seu microscópio para contraste de fase
Todos os componentes necessários para o contraste de fase precisam ser alinhados e centralizados. Alguns controles deslizantes de fase são pré-centrados, portanto, recomendamos que você verifique antes. Os detalhes de como centralizar e alinhar componentes de fase estão abaixo:
1. Se possível, configure a iluminação Koehler em seu microscópio.
2. Instale os anéis de fase no condensador.
3. Remova as oculares e substitua-as pelo telescópio de centragem de contraste de fase.
4. Coloque o telescópio de contraste de fase em foco, de modo que a placa de fase e o anel de fase fiquem em foco.
5. Coloque a objetiva de fase de ampliação mais baixa e o anel de fase correspondente no lugar. Por exemplo, uma objetiva 10x Ph1 com um anel de fase Ph1.
6. Observe a placa de fase e o anel de fase através do telescópio de fase.
7. Usando os parafusos de ajuste no condensador, centralize a placa de fase e o anel de fase de modo que o círculo de luz segmentado fique no anel preto.
8. Repita as etapas 4-6 para o restante dos objetivos.
9. Assim que todas as objetivas estiverem alinhadas e centralizadas, remova o telescópio de centragem de contraste de fase e substitua-o pelas oculares.
Você não precisa recentralizar o microscópio de contraste de fase. Recomenda-se, no entanto, verificar regularmente se a configuração está centralizada usando o telescópio de contraste de fase.
Limitações do contraste de fase
- As imagens de contraste de fase geralmente têm halos ao redor do contorno dos detalhes que têm uma alta mudança de fase. Esses halos são artefatos ópticos e podem dificultar a visão dos limites dos detalhes.
- A resolução das imagens de fase pode ser reduzida devido aos anéis de fase que limitam a abertura numérica do sistema.
- O contraste de fase não funciona bem com amostras grossas, pois elas podem parecer distorcidas.
